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          如何正確制備細胞周期實驗樣品?

          細胞周期分析是分子生物學常用的實驗方法,尤其在抗腫瘤藥物研究上使用普遍。但細節處理不好,做得再多也做不出正確的、好看的分布圖。

          今天來策下如何準確制備細胞周期測試的樣品,真的是百試百靈哦!

          簡單介紹下實驗原理

          碘化丙啶(PI)是一種核酸染料,可以與 DNA 和 RNA 結合,但其不能透過正常的細胞膜,所以對活細胞無染色作用??赏ㄟ^冷乙醇或其他破膜劑的作用,使細胞膜通透性增加。

          PI 進入細胞內后,選擇性地與核酸結合,RNase 裂解 RNA 后,細胞內染料的熒光量與細胞核內的 DNA 含量成正比。

          通過流式細胞儀檢測單個細胞熒光強度得到相對 DNA 含量,根據各個時相 DNA 含量不同,將細胞分為不同的周期。

          具體操作流程及注意事項

          將對數期的細胞接種于 6 孔板中(2×105 個 / 孔,根據細胞大小、增值速度適當調整),每孔加 2 ml 培養基培養。

          細胞貼壁后(根據細胞具體情況),去除培養基,分別加入培養基配置的不同濃度藥物 1 ml 孵育(不使用造成細胞大量死亡的藥物濃度和孵育時間)。

          藥物作用結束后,收集培養液,1500 rpm,離心 4 min。一定要一并收集漂浮的死細胞,不然會嚴重影響結果。

          消化收取貼壁細胞,吹打過程一應要輕柔充分,避免細胞受損、細胞黏連;離心轉速為 2000 rpm,離心 4 min(離心轉速不要超過 2000 rpm,也可以采用 1000 rpm,離心 5 min),PBS 洗 3 遍,以去除培養基、藥物殘留及細胞碎片。合并培養液和貼壁細胞。

          注意!注意??!注意?。?!

          整個過程一定要盡量降低操作對細胞的損傷,要吹打輕柔,減少離心次數,轉速不要超過 2000 rpm。

          消化細胞時要保證細胞吹散,不要有細胞黏連,一旦這一步驟沒有消化充分,后面很難再將細胞吹散,后果嚴重。

          測試時細胞濃度一定要根據流式細胞儀的檢測范圍,不然可能會影響準確度。

          今天就策到這里,下次告訴大家 FlowJo 軟件分析細胞周期相分布時的注意事項,因為作者發現有 SCI 文章的流式周期分布圖,明顯是造假出來的,哈哈哈哈……

          2022-03-21 10:32
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